一、研究的目的与意义 流行性感冒(influenza)简称流感, 是流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒侵入呼吸道纤毛柱状上皮细胞并在其中增殖，引起呼吸道表面炎症和全身中毒症状。其典型临床特点为急起高热、全身疼痛、软弱乏力，但呼吸道症状轻，病程一般3-4天。因其潜伏期短、起病急、经呼吸道飞沫传播，流感病毒特易变异，人群对流感的变异株普遍易感，因而易发生世界大流行，是一种严重威胁人类健康的疾病。流感病毒抗原性极易发生变异，它能够逃脱宿主的防御并导致疾病的流行，控制难度大，因而流感具有相当高的发病率和由严重并发症造成的高死亡率。流感的流行在18~19世纪即有记载,进入20世纪有病原学报告的至少有过4次全球性的大流行,夺取数千万人的生命,给人类造成巨大的灾难。近年来，国内甲流、禽流感相继暴发，给国家造成了巨大的经济损失。2009年我市大学流感暴发，涉及到全校3000余名学生，为保证疫情不扩散，采取了学校停课，封闭管理。加强流感的监测及时发现流感流行的优势毒株，进行流感暴发流行的风险评估，及时进行预警，并提出有效的预防措施。同时为国家流感实验室提供优势疫苗毒株，控制流感大流行。 二、研究内容和解决的关键问题 （1）流感疑似病例核酸的Real-PCR检测； （2）利用MDCK细胞对流感确诊病例进行病毒分离。 （3）利用鸡胚对流感确诊病例进行病毒分离。 三、技术特点和创新点 1、创新之处： 首次研究如何利用Real-PCR技术的TC值提高流感病毒分离效率，得出结论：MDCK细胞分离流感病毒时，Ct值已经在阴性范围之内的样品也应进行病毒分离，以提高病毒分离率；鸡胚分离流感病毒时，应选择MDCK细胞接毒一代且滴度达到1：128的强毒株进行分离。 2、技术特点 （1）Real-PCR技术是在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号变化来即时测定特异性产物的量。其特点是：检测速度快，检测过程仅需2小时；采用封闭的检测模式污染小；可同时进行多流感亚型检测，特异性强，检测更准确。 （2）利用MDCK细胞进行流感病毒分离，通过抗原性分析，有利于发现并分离到有意义的流感病毒新变种。 （3）利用鸡胚对原始标本进行流感病毒分离，为国家流感实验室生产流感疫苗提供毒株。 （4）、通过对病毒分离培养法、实时荧光PCR法和鸡胚培养法3种检测流感病毒的方法和结果进行比较研究，筛选快速准确的检测方法，为流感监测与防控工作提供及时可靠的病原学依据。 （5）、实时荧光PCR法在流感病毒分离中比病毒分离培养法和鸡胚培养法灵敏快捷、特异性强、敏感度高，适合流感病毒的快速检测。 （6）、本研究最重要的技术特征是，引进天隆公司的 NP968核酸自动纯化系统，替代了传统的手工核酸提取法（QIAGEN 试剂盒）。 该技术的适用范围和安全性：天隆NP968 核酸提取仪是依据磁珠吸附原理，运用纳米技术制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠，能与核酸分子特异高效地结合，利用氧化硅纳米微球的超顺磁性，在Chaotropic盐和外加磁场的作用下，经洗脱即得到纯化的核酸。磁珠法是目前世界上最先进的核酸提取技术。手工提取的QIAGEN试剂盒法需要多次离心和液体转移，每一步都要用手工完成， 操作步骤繁琐，提取时间较长，对环境的要求和实验人员的要求高，不适合大量样本筛查工作。 自2015起我中心的流感监测哨点医院由2个变为3个，在流感季（10-3月）每周至少检测流感样本120份，传统的手工提取技术已经无法满足需求，而天隆NP968 核酸提取仪法操作简单，提取时间短，需要的标本量少，提取效率高，提取的核酸纯度高，检测重复性好。将以前至少需求48小时才能完成的流感检测项目，时间缩短了至四分之一，不但如此该方法的提取过程减少了人工操作，避免人工操作引起的差异及错误，具有内置可定时紫外消毒功能，可严格控制孔间污染及批次间污染，杜绝交叉污染，封闭提取仓减少了操作者与试剂的接触，避免有害物质对人体的危害，适合大量标本检测，更能较好地适应大规模集中化检测。 2015年至今我中心共检测流感样品4200余份，从未出现过样品间的交叉污染，通过抽检自查，实验重复率达到100%，这是手工提取方法所无法达到的水平。 利用该技术，我们在流感的高发季节，快速筛出流感病毒，确认流感病毒的型别，可为我市流感的防控提出了科学的依据，该技术在创造巨大的社会价值的同时，也创造同样的经济价值，手工提取的QIAGEN试剂盒，是德国QIAGEN公司的产品，由于专利技术等原因，所以价格比较高，NP968核酸自动纯化系统为我国天隆公司自主研发的产品，所以提取一份样品的成本仅为手工提取的三分之二，该技术的应用必将为流感防控事业做出巨大贡献。

牡丹江市疾病预防控制中心

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