1 课题的来源与背景 1.1课题来源：黑龙江省自然科学基金联合引导项目。 1.2课题研究背景 随着我国蔬菜产业结构的不断调整和完善, 蔬菜作物的重茬、连作及周年生产导致病虫害逐渐加重, 且新的病虫害不断爆发, 严重影响蔬菜的产品质量。迄今为止, 农药一直是防治农作物病虫害和提高农作物产量最快捷、最普遍的方法之一[9], 并已经得到广泛使用。2001年时中国生产农药数量就将近7万t并且逐年递增, 2006年时超过美国, 成为全球第一农药生产大国, 2015年的生产量超过370万t, 平均增长量为去年的3.58倍。其中只有一小部分出国, 其余在我国使用[10]。据报道, 2014年, 我国单位耕地面积的农药使用量为世界平均水平的2.5倍以上, 每年农作物污染面积高达12亿亩, 重度污染达40%, 每年因蔬菜农药残留超标而引起的中毒事故达10万次人[1]。农药虽然是我国蔬菜生产中必不可少的能够有效防止病虫害及提高作物的产量的重要手段之一, 但是农药带来的安全隐患和环境污染等问题也不容小觑。 2 研究的目的与意义 黄瓜是棚室主栽蔬菜作物之一, 在生产中黄瓜易受多种病虫害的侵染, 使其产量和品质受到严重影响。长期使用化学药剂进行病害防治, 易导致农药残留量超标, 大量的农药残留会造成食品安全、环境污染等问题, 同时也会增加生产成本。溴氰菊酯可以有效防治瓜菜类的虫害, 但是由不正确(过量)地使用导致溴氰菊酯威残留量严重超标, 严重危害消费者健康。因此, 研究黄瓜中低溴氰菊酯残留量的问题对提高黄瓜的商品价值, 为消费者提供绿色、安全、无污染的产品至关重要。本研究以前期实验室筛选出的D9320(高溴氰菊酯残留品系)和D0351(低溴氰菊酯残留品系)为材料, 利用Solexa高通量测序技术,结合qPCR筛选到CsWRKY30显著上调表达, 推测可能参与调控霜溴氰菊酯残留性的网络。综上, 为响应中央关于农药化肥“两减”的民生问题, 为培育优质, 安全, 低溴氰菊酯残留的黄瓜新品种, 综合利用生物信息学, 分子生物学, 功能基因组学等多学科技术手段, 分析CsWRKY30基因降低黄瓜溴氰菊酯残留分子作用机理, 为今后开展黄瓜高品质分子育种奠定基础。 3 主要论点与论据 本研究在前期获得CsWRKY30的基础上, 对其进行亚细胞定位、表达特征和功能分析, 明确了其对黄瓜果实溴氰菊酯残留性的影响, 从而为低农药残留性的黄瓜新品种选育及分子育种奠定基础。成功克隆CsWRKY30基因全长, 1014 bp, 共编码337个氨基酸, 理论分子量为83.695 kD, 等电点为5.09, 平均亲水系数是0.814, 具有典型的WRKY结构域, 属于WRKY转录因子家族中的一员; 基因的蛋白序列同源性比对发现, 黄瓜与甜瓜的蛋白序列同源性最高达95%。相同霜霉威胁迫下, CsWRKY30在高农药残留品系D9320中表达量没有差异, 在低农药残留品系D0351中表达量显著高于对照, 且主要在胁迫前期表达, 该基因主要在果实中表达。CsWRKY30基因定位于细胞核。成功构建植物过量表达载体Pcambia1303-CsWRKY30, 并利用农杆菌介导将重组质粒转入拟南芥与黄瓜, 获得抗性植株。过量表达CsWRKY30基因对拟南芥霜霉威胁迫具有一定的耐受性。CsWRKY30基因受ABA信号的诱导, 并对多住棒孢菌胁迫具有一定的响应, 对高盐和干旱无响应。 4 创见与创新 (1)本研究克隆了黄瓜CsWRKY30基因,分析受溴氰菊酯胁迫处理下, 溴氰菊酯残留性存在差异的黄瓜品种不同时期和不同组织的表达模式, 同时进行组织特性表达分析, 比较分析了不同黄瓜品种中基因在溴氰菊酯胁迫下表达情况。 (2)首次对黄瓜CsWRKY30基因在溴氰菊酯胁迫处理时发挥的功能方面做了初步分析, 发现溴氰菊酯胁迫处理下, 过表达CsWRKY30基因的拟南芥具有较强的生长能力和较低的农药残留, 其研究结果丰富并完善了黄瓜WRKY家族基因信息, 为进一步研究黄瓜低农残性的分子机制以及利用相关基因进行分子育种奠定了基础。 (3)针对当前黄瓜遗传转化体系转化效率低下问题, 本项目对黄瓜品种649和D9320的遗传转化体系中不同筛选策、农杆菌侵染时间等进行优化外, 从而针对品种建立了一个转化效率较高的黄瓜遗传转化体系, 为研究黄瓜基因功能及分子育种提供技术保障。 5 社会经济效益 黄瓜果实中农药霜霉威残留量是影响黄瓜安全食用的一个重要因素。本项目要解决的科学问题，来自于生产实践，通过揭示黄瓜果实中低农药溴氰菊酯残留性的分子机制，可以为获得低农残基因资源，低农残种质资源，选育低农残品种，降低黄瓜农药残留寻找新的有效的解决途径，同时也为今后开展黄瓜农药低残留分子育种奠定理论和实践基础。

东北农业大学

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