⑴课题来源与背景 国家公益性行业（质检）科研专项. 基于LAMP技术的动物疫病口岸快速检测体系研究（子课题）. 课题号：201210018-3 壶菌是两栖类的一类病原真菌，属壶菌门壶菌纲，起源于非洲，因日益加强的两栖类国际贸易而呈世界性分布，已成为全球最重要的动物新生传染病之一。对野生两栖类动物种群和区域生态的危害性超过其他任何已知传染病。 壶菌的传播难以控制，一旦传入难以有效清除。壶菌的传播，一是依赖牛蛙等的国际贸易而传播。据联合国商品贸易统计数据库的相关数据显示，全世界每年大约有1万吨蛙腿用于贸易，这些蛙腿国际贸易的总额约为4000万美元，涉及全球上百个国家和地区；另一个数据显示美国主要入境口岸蛙类年进口额就达510万只。我国牛蛙年销售额约为4亿元，涉及北京、天津、山东、河南、江苏、上海、浙江、福建、台湾、广东、广西、安徽、湖南、甘肃、四川、云南和新疆等17个省(市、区)，这都加速了壶菌蔓延，侵染本地种群，而且由于经济等原因而无法控制。二是壶菌可以从被感染地区沿着水体传播到其它健康水体，在昆士兰、维多利亚和西澳大利亚的研究发现，壶菌以大约每年100公里的速度传播，这也增加了传播的偶然性和不确定性。韩国2006-2007年已经在三种土著两栖类中发现壶菌，作为与朝鲜半岛一衣带水的中国，壶菌生态风险骤增，从韩国检测到壶菌的地点(汉城附近)算起，到达我国长白山脉东部的直线距离不过480公里，按照上述的传播速度，如果不考虑其它因素对传播的影响，韩国的壶菌对我国的影响非常值得我们去研究。 ⑵研究的目的与意义 野生和饲养两栖类种群中壶菌病的死亡率高达100% 。到目前为止已报道感染将近150种两栖类，3000多种（占全世界种类数量一半）两栖类种群数量严重下降，甚至灭绝，患病成蛙腹部、髋部、腿部皮肤弥散性红肿、增生、表皮脱落，行为和体态异常，对外界刺激丧失反射。两栖类幼体是病原壶菌的携带者，但外观健康，不表现明显的临床症状，是病原真菌的宿主库。由于壶菌的寄生，破坏了两栖类皮肤的电解质转运功能，导致心肌功能的病理性改变，使被感染两栖类动物最终死于心衰。Matthew和FISHER从对北美国际贸易中进口的两栖动物进行监测；同时Lisa等也积极开展壶菌来源追溯工作，矛头指向中国等亚洲国家，发达国家也在积极考虑限制疫源地的两栖类出口贸易，如果我国不及时采取措施，使壶菌成功入侵，两栖类的养殖与国际贸易必将遭受严重打击。 两栖类壶菌的实验室和现地检测方法主要为纯培养后的形态学和分子生物学鉴定，但对实验人员的要求较高；对实验室的生物安全也有一定的要求。如何高校开展现地检测，确保不造成二次污染成为诊断技术的重要研发目标。此外，在非两栖类取得成功的环介导恒温扩增技术（LAMP）快速检验技术因水生生物病原的多种未知特性的影响，急需重新建立和优化，即通过生物信息学手段，强化LAMP引物设计过程中目的片段的生物学特征，确保其特异性；深入比较现有不同荧光染料在结果判读上的优劣，筛选高效、高性能的荧光染料；尝试通过控制引物设计和引物数量，以及引物及其他试剂的配比，优化、建立上述多重LAMP技术；并注意在研究过程中探索控制假阳性的方法；通过广范的田间验证试验，确保单一和多重LAMP检测方法的可靠性，特别是其特异性、可重复性等生产实践上重要的指标，最终开发多重LAMP检测试剂盒，在检疫、养殖和环保等行业推广应用。 ⑶主要论点与论据 依据LAMP技术原理，根据GenBank公布的壶菌标准株——AY598034的基因序列，针对壶菌保守区域的序列设计了壶菌的LAMP检测方法的4条特异性引物，分别为外引物F3、外引物B3、内引物FIP和内引物BIP，以壶菌标准株——AY598034为模板，建立了检测所有壶菌的LAMP方法。然后依据电泳图谱诊断。 ⑷创见与创新 ①LAMP技术由日本学者Notomi等发明的一种新型的基因扩增技术。但是，目前尚没有将LAMP技术应用在壶菌的检测上。 ②本发明利用特异引物，以识别壶菌靶基因的几个特定区域，特异性更强。反应在等温条件下进行，不需要循环仪等昂贵的仪器，扩增反应极快，一般30分钟完成，扩增产物量大，利用电泳检测或荧光染料技术鉴定出待测样本是否含有壶菌；灵敏度高、特异性强，适合壶菌的快速准确检测。 ③本发明LAMP技术不需要单独反转录过程和巢式PCR的二次扩增，减少分子检测的一些环节，降低了检测的污染率。且实验证明检测灵敏度比PCR高100倍，是该方法对两栖类壶菌病的早期诊断更准确。可广泛用于样本快速检测、壶菌流行监控。 ⑸社会经济效益 该项目通过服务企业，增加营收，带动了当地劳动力在企业就业，以及通过企业扶持当地农民创办蛙类养殖企业带动就业，在全国两个林业局和七个养殖企业试用，8年约获得效益近2000万元。

东北林业大学

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