1. 课题来源与背景： 黑龙江省自然科学基金 2. 研究目的与意义： 漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，其催化氧化的底物十分广泛，因此在工业上具有广泛的用途。目前研究得最多的漆酶大多来源于真菌，但多数产漆酶的真菌生长缓慢，难以进行工业化大规模发酵培养，导致漆酶的制备成本较高。此外真菌漆酶在高温、碱性或高盐等环境中容易失活而难以发挥作用。相对于真菌漆酶而言，细菌漆酶具有较高的稳定性，在工业应用上具有更好的前景。但细菌漆酶的应用还存在一定的局限性，主要表现在自然来源的细菌漆酶的产量和酶活相对较低，所以提高细菌漆酶活性并降低生产成本是推动其工业化应用的前提条件。 前期研究从森林土壤中筛选到一株产漆酶的解淀粉芽孢杆菌LC02，该漆酶表现出较好的稳定性，光谱分析表明其是一种新型的非铜蓝细菌漆酶。分子改造及高效外源表达是提高工业酶催化活性和产量的有效手段，同时针对突变位点的分析有利于加深对酶分子催化机制的认识。为了进一步提高解淀粉芽孢杆菌LC02漆酶的重组表达和催化活性，本研究采用E. coli两阶段诱导表达方法结合定点突变和结构域重组等技术，对其进行了分子改造提高其对木质素模型化合物等有机化学物的催化活性，同时优化了突变漆酶的表达活性，为后续开发高稳定性的细菌漆酶并用于木质素等污染物的降解奠定了基础。 3. 主要论点与论据 采用序列比对和结构分析的方法选定解淀粉芽孢杆菌LC02漆酶（LacA）活性中心D501和结构域3作为突变目标，通过定点突变和结构域重组得到突变漆酶D501G和Lac3A/S。利用好氧-微好氧两阶段诱导方式实现了野生型漆酶和两种突变漆酶在E. coli中的胞外表达。 优化了影响重组漆酶表达的条件，铜离子的添加和微好氧条件诱导在漆酶的高活性分泌表达中起到重要作用，漆酶的分泌主要发生在微好氧阶段。优化后LacA的表达量提高了4.7倍左右，Lac3A/S的表达活性高达13142 U/L，高于大多数细菌漆酶的表达活性。 突变体D501G和Lac3A/S的催化效率比LacA分别提高了3.7倍和1.2倍，此外D501G和Lac3A/S表现出比LacA更强的耐碱性和更高的热稳定性。结构分析表明D501G突变体在T1 Cu活性位点附近具有更小的空间位阻和更高的构象灵活度，Lac3A/S活性中心Cu与氨基酸的结合距离缩短从而具有更紧凑的空间结构，因此突变漆酶表现出更高的底物催化效率和稳定性。 突变漆酶对木质素模型化合物和有机染料表现出较好的催化活性，D501G在碱性条件下5 h内对靛红的降解率是LacA的3.5倍，Lac3A/S对愈创木酚和2,6-二甲氧基苯酚的催化活性分别比LacA提高了2.1和2.8倍。 4. 创见与创新 目前大肠杆菌表达系统表达的重组漆酶往往位于胞内，需要采用超声波或化学试剂等方法破碎细胞才能提取重组蛋白进行分析，不仅增加了突变文库筛选的工作量，且细胞破碎后释放的许多杂蛋白会影响后续分离纯化。大肠杆菌表达系统的另一缺点是重组蛋白容易形成无活性的包涵体，进而会影响重组蛋白的表达量。本研究采用好氧-微好氧两阶段诱导方式结合表达条件的优化实现了细菌漆酶的高效胞外表达。同时基于结构分析获得了两个漆酶突变体，突变漆酶表现出比野生型漆酶更高的底物催化效率和稳定性，为后续开发细菌漆酶在木质素等有机物污染物降解的应用奠定了基础。 5. 社会经济效益，存在的问题 细菌漆酶具有较高的稳定性，在工业应用上具有较好的前景。本研究获得的细菌漆酶突变体及其胞外高效表达体系为在实验室构建，需要进一步将发酵体系放大并优化发酵参数，提高漆酶的表达活性，以达到降低生产和使用成本的目的。 6. 历年获奖情况：无。

东北林业大学

该项目为储备库项目资源，暂无效益分析内容。