研究背景： 卵巢癌发生和发展是多基因参与、多阶段进行的复杂的过程, 寻找与卵巢癌相关的抑癌基因、原癌基因及功能研究已经成为目前研究热点。基因治疗肿瘤的关键是准确选定目的基因，并使目的基因可以稳定、高效的在肿瘤部位表达, 以期达到最佳的治疗效果。 在近年的研究中，课题组以"卵巢癌相关致病因子及作用机制"为主要研究目标进行了一系列的研究，并取得了相应的研究结果。 研究方法及结论： 1、 利用重组腺病毒将内皮抑素转染至骨髓间充质干细胞，通过Millicell系统在体外观察间充质干细胞对肿瘤的定向性。携带内皮抑素的间充质干细胞与SKOV3细胞非接触式共培养48h，检测SKOV3细胞的凋亡情况及细胞周期。 2、 免疫组化法验证HSP27高表达与卵巢上皮性癌的关系。采用脂质体转染法将HSP27 stableTMsiRNA转染至卵巢癌细胞系HO8910，RT-PCR及Western blot检测HSP27基因mRNA及蛋白表达情况。通过噻唑蓝比色法（MTT）对细胞生长状况进行检测和流式细胞仪对细胞凋亡（Annexin V/PI双染法）进行检测验证了沉默HSP27基因后增强了紫杉醇对卵巢癌细胞系的杀伤作用。以2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)为探针检测胞内活性氧（ROS）水平，并以微量细胞克隆形成法（Clonogenic assays）检测N-乙酰半胱氨酸（NAC）对ROS产生的影响，进而探讨ROS在此过程中发挥作用的机制。 3、 采用脂质体转染法将含有特异性小分子干扰Grp94 mRNA的重组载体psiSTRIKETM/Grp94（特异siRNA）导入卵巢癌细胞系HO-8910中，分别在转染前、转染后24h、48h和72h通过RT-PCR、Western blot和免疫荧光技术检测Grp94 mRNA 及蛋白水平的表达情况，用流式细胞仪检测细胞凋亡。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定细胞经梯度浓度顺铂、紫杉醇及阿霉素处理后的细胞存活率。将HO-8910细胞注入裸鼠皮下，成瘤后瘤内注射含有特异性小分子干扰Grp94 mRNA的重组载体及脂质体的混合物，观察移植瘤的生长情况及化疗药物的治疗效果。将含有特异性小分子干扰Grp94 mRNA的重组载体及脂质体的混合物注入裸鼠体内，观察对卵巢癌移植瘤形成的预防作用。 4、 应用细胞培养技术、基因克隆技术、RT-PCR技术、免疫组织化学技术、流式细胞术、透射电镜等现代先进的分子生物学技术，在国内首次应用这些先进的实验方法在卵巢癌组织中研究了DCC基因的表达情况，利用体外细胞试验探讨了该基因对卵巢恶性肿瘤发生发展的影响。 5、 设计构建含有靶向ILK的shRNA和慢病毒即编码天然型增强绿色荧光蛋白（EGFP），转染卵巢癌细胞系SKOV3。实验分组空白转染组（LV-NON），阴性对照组（LV-NC），实验组（LV-ILK），SD组。转染72h后的细胞，通过绿色荧光蛋白发光情况在荧光倒置显微镜下，判断目的基因ILK导入情况。通过Western blot验证。应用WST-8测定细胞活力、Hoechst染色、以及通过western blot检测caspase、Bcl-2、Bax、Fas、Fas-L等凋亡蛋白的表达和caspase-3活力的检测,流式细胞仪检测凋亡率。 研究结果： 1、 骨髓间充质干细胞在体外具有对肿瘤细胞的定向作用。由转染后的间充质干细胞分泌的内皮抑素可以抑制SKOV3细胞增殖。骨髓间充质干细胞可以成为内皮抑素有效的基因载体。 2、 HSP27基因沉默部分抵消了HSP27蛋白抵御氧化应激的作用，因而间接地增加了卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。stableTMsiRNA诱导的HSP27基因沉默是一种在上皮性卵巢癌细胞中帮助克服对紫杉醇耐药的新策略。 3、 构建的RNA干扰真核表达载体psiSTRIKETM/Grp94能明显抑制Grp94 mRNA及蛋白的表达，增加卵巢癌细胞的化疗敏感性。RNAi为卵巢癌的基因治疗提供了一种新策略。 4、 DCC基因表达缺失与卵巢恶性肿瘤的发生、发展及转移、浸润有关。在正常卵巢组织，DCC基因全部正常表达；在卵巢恶性肿瘤中，尤其在卵巢上皮性癌中，DCC基因呈现缺失表达；在病理分级越高、组织学分期越高、分化程度越低、伴有盆腹腔转移的组织中缺失表达更常见。DCC基因可明显抑制卵巢癌细胞生长，在卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用。DCC基因在人卵巢恶性肿瘤中的表达研究、脂质体介导的DCC基因对卵巢上皮性癌细胞系SKOV3细胞生长的抑制作用研究工作，试验结果理想，与预期结果完全吻合。 5、 慢病毒作为RNA干扰载体，可以成功将目的基因ILK导入SKOV3细胞中，发挥其基因沉默作用。下调ILK的表达可以诱导卵巢癌凋亡,并且可能或至少部分经过线粒体途径及死亡受体途径。RNAi沉默靶基因ILK可以成为治疗卵巢癌的有效靶点。 研究成果： 在近年的研究中，课题组以"卵巢癌相关致病因子及作用机制"为主要研究目标进行了一系列的研究，并取得了相应的研究结果。近5年相关研究内容发表中文核心期刊文章数十篇，SCI收录15篇，SCI收录文章单篇被引5次以上文章5篇。课题组成员申请承担国家级课题2项，省级以上课题5项。

哈尔滨医科大学附属第二医院

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