1、 课题来源与背景；国家青年基金项目。 白桦三萜类成分白桦脂醇、白桦脂酸及其衍生物在抗HIV 病毒和抑制肿瘤方面具有显著的疗效。白桦各种三萜成分（白桦脂醇、齐墩果酸、达玛烯二醇、固醇等）是以乙酰辅酶 A 原料经甲羟戊酸途径（MVA）在细胞质中合成，均来自共同的前体物质2，3-氧化角鲨烯，在不同三萜合酶基因（LUS、CAS、b-AS、DS）的调控下，沿着各自的代谢方向进行生物合成，这就导致几种产物之间产生竞争同一前体，并相互抑制合成。本研究通过共代谢途径前体基因FPS 的过表达及RNAi 技术介导的分支途径的阻断，对白桦三萜代谢流分配进行分子调控，以促进目标产物白桦酯醇和白桦脂酸的合成与积累。 2、研究目的与意义； 本申请项目是在实验室已建立的成熟的白桦组织培养、遗传转化体系基础上提出的，依据三萜物质合成的异戊二烯（MVA）途径和掌握的关键酶基因表达特性，推测在白桦植株和细胞中固醇合酶基因（CAS，环阿齐醇合酶）基因和达玛烷烯二醇合酶（DS）基因的高度和稳定的表达，可能是限制白桦三萜关键活性成分白桦酯醇和齐墩果酸积累的主要因素。拟通过共代谢途径前体基因FPS的过表达及RNAi技术介导的分支途径的阻断，对白桦三萜代谢流分配进行分子调控。研究三萜合成前体FPS基因过表达，分支途径DS、CAS分别抑制和共抑制对白桦组织生长、总三萜合成、组分积累及相关基因表达特性，重点探讨三萜组分积累的消长关系，三萜前体对分支途径的贡献及代谢流分配机制。该研究不但有助于掌握植物次生代谢的分子调控规律，而且对生产实践中解决植物及其培养细胞目标次生产物低产问题均具有重要意义。其开展将为白桦三萜类物质代谢工程遗传改造和生物技术利用提供技术支持和理论依据、为丰富次生代谢分子调控理论奠定基础。 3、主要成果； 1）、 首次在我国中国东北白桦（Betula Platyphlla suk.）中克隆三萜合成途径关键基因5 个，完成序列分析。包括MVA 途径FPS、三萜合成途径白桦环阿齐醇合酶（CAS）、BPX3、编码新鲨烯环氧酶BpDS、鲨烯合酶基因SS鲨烯环氧酶基因（SE），完成各基因氨基酸序列分析，系统进化树构建。 2）、 明确白桦三萜合成途径关键基因表达特征 在生长季节内，叶片中 BPX1以及 BPX2两个基因在 9 月末表 达量高，而 BPW和 BPY表达量均较低；茎皮中 BPY 基因在 7 月末和 9 月末分别出现了两个高峰期。一年生白桦叶中BpDS 基因表达量在5 月最低，9月与7 月BpDS 基因的表达量最高。BpDS 基因的表达显著受 乙烯和ABA诱导，根和叶中BpDS 基因表达量高于茎。表明三萜基因的表达同三萜的积累和分布类似，显著受到季节调控，并受激素诱导，具有组织特异性。 3）、获得高产白桦三萜前体角鲨烯的转基因酵母菌株 为研究BpSS 基因的功能，将重组酵母菌和对照酵母菌分别诱导培养12 h,进行三萜代谢途径中鲨烯合成酶产物鲨烯的提取和HPLC 检测。诱导12h 后的重组酵母菌鲨烯的产量为对照酵母菌产量的13.2 倍。重组酵母菌的产量是未诱导基因表达的酵母菌产量的3.23 倍。结果表明，白桦BpSS 基因的功能是在三萜代谢过程中参与合成鲨烯。应用真菌/酵母角鲨烯环氧化酶活性光度法定量检测试剂盒测量重组酵母和对照酵母菌的鲨烯环氧酶的活性。结果发现，诱导表达的重组酵母INVScl（pYES2-BpSE）酶活性为0.2314pkat/g 是对照酵母INVScl（pYES2）的11.84 倍。对照酵母INVScl（pYES2）和未诱导表达的重组酵母INVScl（pYES2-BpSE）鲨烯环氧酶的活性差异不大。 4）、明确白桦BPX（CAS）、BpDS 单、双基因RNAi 对三萜合成及分配调控作用 完成白桦FPS、SS 及BpDS、BPX 单、双基因干扰载体遗传转化及分子鉴定，获得转基因白桦26 株。获得的BpDS RNAi 转基因白桦苗4 株，其中转基因株系Y21 和B3 的 BPY 基因的表达量显著被抑制，分别为照相的2%和9%。转基因白桦Y21 白桦脂酸、齐墩果酸和白桦脂醇含量均显著高于野生型对照，Y30白桦脂酸比野生型提高85%。获得环阿齐醇合酶基因BPX23-D 的RNAi 转基因白桦苗4 株，其中Y-12、B-6 的BPX2 基因的表达被显著抑制，表达量分别为对照的3%和48%，而BPY 和BPW 的表达量被显著提高；B6、Y12 齐墩果酸含量比野生型高 7.86 倍和4.93 倍；而B6 和Y12 白桦脂酸含量比野生型高1.03 倍和1.65 倍。转基因植株B6齐墩果酸和白桦脂酸含量分别达2.4mg/g和0.65mg/g，明确BPX2基因干扰后可溶性糖含量、三萜前体角鲨烯含量均不同程度提高，BPW 和BPY 基因显著上调，均不同程度促进了三萜前体物质向下游目标三萜产物白桦脂酸和齐墩果酸的合成与积累。该研究结果为通过基因工程手段进行白桦三萜途径遗传改良奠定了基础，获得的转基因白桦为白桦三萜类药物进一步应用提供了材料资源。 4、创新点：通过基因工程和细胞工程手段进行白桦药用成分高效合成的定向改良，获得的转基因白桦为三萜类药物进一步应用提供了材料资源，为创造能源白桦新种质及生物反应器发小生产白桦脂酸和齐墩果酸药物成分奠定了基础。

东北林业大学

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