一、研究的目的和意义 kallistatin具有抗炎、抗凋亡和抗氧化的作用，并且在心脏和肾脏缺血再灌注损伤，以及在内毒素休克等方面的研究已经取得进展。但目前在小肠缺血再灌注方面尚属空白，通过medline文献检索，这方面的研究鲜有报道。 本研究提出通过基因转染kallistatin可以减轻缺血再灌注损伤的设想。通过构建kallistatin腺相关病毒表达载体Kalli-AAV，门静脉灌注后在肝脏稳定表达及分泌kallistatin,随体循环分布到各器官组织中。通过在小肠缺血再灌注后多器官损伤的动物模型中，检测小肠、肝脏、肾脏、肺脏以及心脏等远隔器官的形态学和血清学等指标，评价kallistatin的作用效果；通过体外细胞培养，观察细胞的凋亡、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和细胞间黏附分子1（ICAM1）表达、 内皮型一氧化氮合酶的活性、p22phox表达和超氧化物含量等，探索其分子机理。为解决小肠缺血再灌注后多器官损伤这一外科难题提供理论依据。 二、研究内容和解决的关键问题 （1）研究内容 本项目是申请者在前期研究的基础上（牛磺酸对兔肝脏缺血再灌注损伤的保护作用、牛磺酸对大鼠小肠缺血再灌注后多器官损伤的保护作用、 AAV-Kalli病毒载体的构建 、AAV-Kalli病毒的包装和纯化），继续延伸的一项针对小肠缺血再灌注后多器官损伤的基因治疗以及分子机制的新探讨。 ①体外实验部分――分子机理探讨 原代培养多脏器细胞，进行AAV-Kalli的体外转染，因为AAV可以转染原代和非分裂期的细胞。检测kallistatin在细胞内的表达情况。将转染后的细胞进行缺氧-再充氧处理后，进行细胞凋亡、细胞活力、caspase-3活性的检测，以了解kallistatin蛋白在分子和细胞水平对脏器的保护作用。 ②实验动物的分组 健康雄性Wistar大鼠，体重250±20g(Harlan, Indianpolis, IN)。 将实验动物分为如下四组：（1）假手术组； (2) 小肠缺血再灌注生理盐水组；(3) 小肠缺血再灌注空壳AAV治疗组；(4) 小肠缺血再灌注Kalli-AAV治疗组。 ③指标的检测 肝脏、肾脏、小肠功能测定；重组kallistatin在大鼠肝脏的表达；组织学和免疫组化分析；细胞凋亡的检测；蛋白印迹分析； NADH氧化酶活性和过氧化物测定；实时定量PCR； 三、主要成果： 本项目在国内核心期刊发表研究论文全文2篇，SCI 收录1篇。本研究提出通过基因转染kallistatin可以减轻缺血再灌注损伤的设想，为解决小肠缺血再灌注后多器官损伤这一外科难题提供理论依据。 四、结论 小肠对缺血再灌注损伤非常敏感，小肠缺血再灌注后小肠及多器官损伤一直是外科研究的热点及难点，小肠I/R损伤不仅使小肠受到损害，还可以因小肠内内毒素释放和细菌移位，使多器官都会受到损伤，严重时可引起MODS。小肠I/R虽常见但其机制非常复杂，至今尚未彻底阐明。越来越多的研究证实，Kallistatin在不同的组织中展现出抗凋亡、抗氧化和抗炎等多方面的功能。但Kallistatin抑制小肠细胞的凋亡，减轻小肠缺血再灌注后引起的小肠细胞损伤及其具体机制方面尚无报道，本研究首次应用kallistatin对抗小肠缺血再灌注后多器官损伤的研究；首次从高深度、宽广度探讨kallistatin对小肠缺血再灌注后多器官损伤的影响，从分子通路角度揭示缺血再灌注损伤的机制。 本研究通过按佟立权等建立大鼠小肠缺血再灌注模型，检测小肠缺血再灌注后小肠组织的病理变化；同时检测血清DAO,MDA,SOD, 证实Kallistatin预处理一方面上调Bcl-2的表达，下调Bax的表达从而降低线粒体细胞膜的通透性，减少细胞色素C的外流，减少Caspase-3活化来实现对细胞凋亡的调节,另一方面升高血清中SOD水平；同时降低作为氧化应激产物的MDA水平，从而降低小肠细胞的氧化应激水平，最终达到保护小肠细胞，改善HIRI的目的。综上所述，Kallistatin 对小肠缺血再灌注损伤中发挥对抗氧化作用 ，并进一步证实Kallistatin对小肠缺血再灌注损伤保护作用机制。为小肠缺血再灌注损伤的防治提供一种新思路、新靶点及新技术平台。在本研究的基础上，将继续向上级有关部门申请进行临床缺血再灌注损伤基因治疗的临床试验，继续申报国家自然基金项目，将对其机制进一步深入研究。

哈尔滨医科大学附属第五医院

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