课题来源与背景 核酸分子线路本身是核酸分子工程领域的新兴方向，非常有基础理论研究价值。对核酸分子线路的优化，使其成为等温放大中优良的信号传导方式和放大器，颇具应用前景。将核酸分子线路与等温扩增偶联这一概念属于国际首创，是能够让两种技术取长补短，最大程度发挥自身优势的的巧妙设计。 研究目的与意义 在序列的设计中，如何获得稳定高效的长、高温中转核酸链交换探针和核酸放大线路；在核酸链交换反应的创新耦合中，如何保证核酸扩增产物-核酸放大线路-中转探针-比率信号输出间的高效偶联；在下游电化学表征中如何调控电化学探针（亚甲基蓝和二茂铁）信号的协同性和信噪比，增加微芯片电极重现性和再生性，确保电化学测量的可靠性，在最终的器件设计中，如何保证迷你双温区反应器的设计合理性升温速度恒温时长和电机兼容性均为项目中所需解决的关键。 主要论点与论据 针对恶性肠道致病菌（如沙门氏菌）以及肿瘤（如腹主动脉瘤）相关基因分别设计和优化一组或多组 LAMP 和 PCR 引物。针对最优 LAMP 扩增反应的单链产物设计 3W-P 和 A-P，用琼脂糖凝胶电泳进行表征。加工图案化薄膜电极并优化电学性能。开始设计迷你双温区反应器，筹备材料进行最初组装。随时开拓探针对输入的逻辑化响应和其他核酸作用方式。 优化 LAMP-3WSD 体系转移到电化学输出平台，优化电极表面A-P 的修饰条件和密度，取得最佳信噪比和定量浓度区间。电化学信号首先采用图案化薄膜电极，随后转到多孔板集成电极上进行高通量测试。针对最优 LAMP 扩增反应的单链产物设计 CHA 及相应 3W-P。获得迷你双温区反应器雏形，陆续将优化好的 LAMP-3WSD-EC 在双温区检测器进行验证，根据结果进行参数优化。将 CHA 转移到 LAMP-CHA-3WSD-EC 测试和迷你双温区检测器，取得最佳信噪比和定量浓度区间。用1-2 种其他热循环或恒温 PCR 方法替换 LAMP 方法，测试 3WSD 和电化学方法的普适性。测试菌类及临床实际样品，调整和优化条件，建立肠道菌电化学检测方法，与国标方法进行对比。 创见与创新 本项目拟通过对核酸分子链交换技术的灵活运用推动电化学基因法的实用化进程，将诸如3-way链交换（3WSD）、 双发卡核酸催化组装技术（CHA）和比率输出等一系列核酸链交换创新设计智能整合到核酸扩增和电化学信号之间，从根源上依次消除现有基因诊断技术因非特异性识别、扩增效率低和信号噪音高而引发的频发假象误诊，搭建起普遍适用于各种恶性疾病致病基因的超精准、智能化电化学实时传感平台。并构筑可供此传感平台重复使用的迷你双温区反应器，在实现多通道、便携化的同时，为下一步精密电化学核酸扩增检测仪的研发提供可行性依据。项目首选待测物为恶性肠道致病菌（如沙门氏菌）以及肿瘤（如腹主动脉瘤）相关基因。 社会经济效益，存在的问题 项目结束后已完成对恶性肠道致病菌（如沙门氏菌）以及肿瘤（如腹主动脉瘤）相关基因的检测，另外对结核分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄菌和阪崎肠杆菌的检测上也达到99.99%的准确性。如能完成产品成品可降低检测时间和难度。 在分子设计层面，提出“LAMP与CHA串联”的联用型基因检测新技术（简称LAMP-CHA），并对该联用技术的可行性、必要性和技术优势进行初步验证和评估。为下一步精密电化学核酸扩增检测仪的研发提供可行性依据。尽管如此，目前该方法从实验室到真正的产品，还有一段距离。为进一步提高实用性，我们将会把研究重点集中在“强化样品前处理技术”，“临床或实际样品测试”和“进一步简、免标记步骤”等方面。

哈尔滨中科赛恩斯生物技术有限公司

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