为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）全悬浮生产工艺，本研究驯化了一株全悬浮PK15细胞系，命名为PK15-S，利用生物反应器对PK15-S细胞的悬浮培养参数和PCV2/LG株的悬浮培养参数进行探索发现，当PK15-S细胞传代浓度达到40~80×104/mL时培养60~72h，细胞浓度可达到50~60×105/mL；当接毒剂量控制在2~3%、PK15-S细胞浓度为50~80×104/mL、96~120h收毒和溶氧在40~50%之间，PCV2培养滴度可达到106.8~107.2 TCID50/mL之间，然后用中空纤维超滤膜将全悬浮PCV2半成品进行抗原纯化去除杂蛋白79.9%，利用该纯化抗原制备疫苗免疫效检试验猪发现，过氧化物酶单层细胞染色法测定PCV2血清抗体效价介于800~6400之间，免疫组试验猪均未见腹股沟淋巴结肿大，并且最小免疫剂量0.1mL试验组猪腹股沟淋巴结病毒载量均小于3.59×107拷贝/g，攻毒对照组试验猪腹股沟淋巴结病毒载量均大于1.58×109拷贝/g，综上表明，利用生物反应器全悬浮生产工艺生产PCV2半成品可以获得比转瓶工艺高出8~10倍的PCV2抗原，为后续PCV2相关疾病联苗的开发奠定了坚实基础。全悬浮培养工艺已经在动物细胞领域得到了广泛的应用和发展，但是在猪圆环病毒2型大规模全悬浮培养工艺未建立，因此该方法建立了猪圆环病毒2型的全悬浮培养工艺。PCV2全病毒颗粒具有良好的免疫原性，适合做全病毒灭活疫苗，但是PCV2在PK15细胞上的繁殖能力不高是影响PCV2全病毒疫苗质量的最大瓶颈之一。在PCV2培养过程中发现，牛血清对PCV2的繁殖具有很大的影响，不利于PCV2病毒感染PK15细胞，并且由于牛血清的来源和批间差异都造成了PCV2疫苗半成品生产的不确定性，国内外对D-氨基葡萄糖、氯化铵和两性霉素等对PCV2的增殖效果也存在一定的局限性，为了建立PCV2病毒大规模全悬浮高效培养工艺，本研究采用大规模无血清全悬浮培养PK15-S细胞进行PCV2悬浮培养，克服牛血清对PCV2繁殖的影响，获得高滴度的PCV2半成品，从而降低PCV2半成品生产成本，为PCV2疫苗半成品纯化获得高纯度的有效蛋白奠定了坚实基础。PCV2在PK15细胞内复制过程中，病毒滴度低是制约PCV2疫苗质量不稳定的主要原因，PCV2病毒滴度低受到诸多因素的制约，在试验过程中发现，牛血清不利于PCV2在PK15细胞中复制，现在传统PCV2全病毒疫苗半成品生产工艺都是应用转瓶和微载体培养都离不开牛血清，本研究采用全悬浮PK15细胞无血清培养PCV2，取代了传统的转瓶培养工艺，减少了人力资源，提高了产品的质量，解决了PCV2全病毒疫苗生产的瓶颈问题，制备高效价的PCV2半成品，通过PCV2病毒的纯化工艺能够得到更加纯净的PCV2病毒浓缩抗原，为PCV2多联疫苗的研究奠定了坚实基础，减少疫苗的用量，降低了猪群的应激，提高了猪群的免疫水平。该技术应用到PCV2大规模生产，可以减小疫苗批次之间的差异，大大减小了疫苗的批间差异。为我国养猪业健康发展提供了必要技术支持

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

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