本研究第一部分内容为基于线粒体基因组研究东方次睾吸虫系统发育关系。通过比对其他后睾科吸虫线粒体全基因组序列，设计了11对PCR引物，并成果扩增了东方次睾吸虫线粒体全基因组序列和核糖体内转录间隔区（ITS）序列，对东方次睾吸虫线粒体基因组的结构和组成特征进行了解析，其线粒体基因组为闭合环状，其线粒体基因组整个长度为13,834 bp。线粒体全基因组包含12个蛋白编码基因：细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（cox1、cox2、cox3）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、ⅣL、Ⅴ、Ⅵ（nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、nad5、nad6）、细胞色素b（cytb）和三磷酸腺苷酶第六亚基（atp6），2个核糖体编码基因：核糖体RNA大亚基（rrnL）和核糖体RNA小亚基(rrnS)，22个tRNA编码基因，缺少ATP 8基因，所有的基因都位于1条链（即重链）上，基因转录和复制按同一个方向即顺时针方向进行。将东方次睾吸虫线粒体基因组序列提交至GenBank数据库，基因登陆号为KT239342。同时利用12个蛋白质编码基因串联的方式，采用了BI法、MP法和ML法构建系统发育树，分析东方次睾吸虫与其它吸虫的亲缘关系和在吸虫中的分类地位。三种方法构建的进化树结果基本一致。进化树中的后睾科、片形科、异形科、并殖科、同盘科、双腔科和裂体科各自形成分支。其中，后睾科中的后睾属的两种吸虫（麝猫后睾吸虫和猫后睾吸虫）并不在同一分支上，东方次睾吸虫和麝猫后睾吸虫的亲缘关系较其他后睾科吸虫（猫后睾吸虫和华支睾吸虫）较近。该结果为吸虫的系统发生学、群体遗传学的研究提供了理论基础。 本研究第二部分内容为不同地区的东方次睾吸虫线粒体基因组遗传多态性的研究。利用PCR方法扩增黑龙江省齐齐哈尔、肇源和肇东三个地区的东方次睾吸虫线粒体cox1和nad1部分基因，经测序后人工校正比对，pcox1和pnad1基因片段长度分别为699bp和492bp，且三个地点的基因长度均一致。序列经分析显示，三个地点的东方次睾吸虫pcox1序列五个位点发生突变，即165位点G-A，279位点T-C，318位点A-G，441位点T-C，531位点T-C；pnad1序列存在一个位点突变，在171位点出现C-T突变，序列中所有的点突变均为转换，未见颠换现象，且本研究中不同地点的东方次睾吸虫pcox1和pnad1基因的密码子突变均发生在第三位密码子。对其序列分析并构建种系发生树，探讨其遗传进化关系。结果显示，黑龙江省三个地点的pcox1和pnad1基因片段长度分别为699bp和492bp，且基因长度均一致。pcox1基因种内变异率在0~0.7%，种间变异率在12.2%~15.8%；pnad1基因种内变异在0~0.2%，种间变异率在12.7%~23.3%，种间变异要大于种内变异。分子进化树结果显示三个地点的东方次睾吸虫聚集在一起，与次睾属的另两个成员聚集在同一分支，次睾属吸虫与支睾属吸虫的亲源性较后睾属吸虫近。该结果为东方次睾吸虫进一步的分子流行病学和数量遗传学研究奠定了理论基础，同时也为相关吸虫病的诊断和预防提供科学的参考依据。 本研究第三部分内容为东方次睾吸虫分子检测方法的建立。通过对东方次睾吸虫和华支睾吸虫核糖体ITS序列的扩增，利用生物学软件进行序列分析后，建立了东方次睾吸虫虫卵特异性PCR检测方法和一种鉴别东方次睾吸虫与华支睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法，前者通过敏感性试验、特异性试验和重复性试验对该方法进行验证，证明其为一种敏感性高、特异性强、重复性好的东方次睾吸虫虫卵粪便PCR检测方法，最低可以检出虫卵0.03125个/克。同时，利用限制性内切酶XhoI酶切东方次睾吸虫和华支睾吸虫囊蚴DNA，可被酶切的为华支睾吸虫囊蚴，不可被酶切的为东方次睾吸虫囊蚴囊蚴，从而建立了一种鉴别东方次睾吸虫与华支睾吸虫囊蚴的PCR-RFLP方法。最后，利用本研究所建立的分子检测方法对龙凤湿地候鸟87份粪便样品进行检测，结果发现6份为东方次睾吸虫感染阳性，感染率为6.9%。本研究为东方次睾吸虫病的临床诊断方法提供了科学的理论指导。

黑龙江省兽医科学研究所

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