①课题来源与背景； "鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法的建立" 任务来源是：2015年齐齐哈尔市科技局科技计划攻关项目（NYZD - 2015002）成果应用领域为畜牧业。从2015年到2016年，经过近两年的时间，课题组圆满完成了"鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法的建立"的工作目标并取得了理想的成效。 ②技术原理及性能指标； 日本学者Notomi等开发了一种新的核酸等温扩增方法，即环介导等温扩增法（loopmediated isothermal amplification，LAMP），其特点是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，在等温条件下（60℃- 65℃）利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）几十分钟，即可完成核酸扩增反应，具有恒温、快速等特点，有着极为广泛的应用前景。 根据GenBank中的鸭瘟病毒UL6保守基因序列，利用在线生物软件PrimerExplorer V4针对UL6靶基因序列的6个不同区域设计出4条环介导等温扩增引物，初步建立了鸭瘟病毒环介导等温扩增反应方法。本研究对鸭瘟病毒LAMP方法的各反应条件（反应温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、甜菜碱浓度、BstDNA聚合酶浓度、引物比例浓度、反应时间）进行梯度优化，并进行排列组合筛选出最佳反应条件，建立鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）方法；对扩增产物用目测法、电泳法和荧光染料法进行判定；对已建立的鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）方法进行了特异性、灵敏度、重复性试验及可视化处理；检测模拟样品，并与PCR方法进行比较。建立的LAMP方法可在1h左右完成扩增反应，对鸭瘟病毒检测灵敏度是PCR方法的100倍；对鸭瘟病毒基因组样品检测结果为阳性结果，小鹅瘟病毒、鹅副粘病毒、巴氏杆菌、禽大肠杆菌基因组检测结果均为阴性；LAMP和PCR对模拟样品检测结果的符合率为100%。对模拟样品的检测也进一步证明了本方法的可靠性。 本研究建立的针对鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法具有快速、灵敏、特异、稳定、操作简便和结果判定简便等特点，能够对鸭瘟病毒进行快速检测。 ③技术的创造性与先进性； 目前鸭瘟病毒检测的方法有很多，病毒分离、间接ELISA诊断方法、多聚酶链式反应（PCR）、实时荧光定量TaqMan-PCR等。血清学检测方法比较费时、费力；PCR方法对仪器要求又很高，在应用上都有一定的局限。鸭瘟病原学诊断, 为及时有效地防治鸭瘟病，选择特异性治疗方法提供科学的依据；是稳定养殖户情绪，将损害降到最低限度的保证。 ④技术的成熟程度，适用范围和安全性； 目前LAMP技术已广泛应用于各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中。LAMP 还用于微阵列基因芯片的开发。鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法有常规 PCR 方法无可比拟的优势：LAMP的整个扩增过程均在恒温条件下进行，规避了常规 PCR 对于温度升降的步骤，不仅不要使用昂贵的仪器设备，同时也大大缩短了反应时间，更加符合基层兽医站和临床一线对快速诊断的需要。反应副产物焦磷酸镁形成的浑浊度使得反应结果更加容易观察和判定。由于该方法的简便易行，鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）检测方法有望在基层检测中大面积推广。 ⑤应用情况及存在的问题； 课题实施期间，"鸭瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法的建立"在3个县（市）种鸭场进行临床检测共有2474只疑似鸭瘟的发病鸭应用检测，对1964只鸭瘟病鸭进行了早期诊断和治疗，创经济效益近1.964万元，该研究检测方法得到用户的广泛好评。 LAMP 扩增产物不能够进行测序，克隆和表达，它最大的用途就是用于病原微生物的快速检测。 由于LAMP的扩增效率是目前最高的一种，其灵敏度比传统PCR高出约2-3个数量级，能够达到几微克，使得LAMP因开盖取样进行凝胶电泳检测或加染料进行检测容易造成的模板气溶胶污染。在本方法建立的过程中，阴性对照曾被污染而出现假阳性。通过严格的分区操作最终避免了模板污染问题。 ⑥历年获奖情况； "小鹅瘟病毒环介导等温扩增（LAMP）快速检测方法的建立"获省畜牧科技进步三等奖。 “寒区肉牛健康养殖环境控制配套技术的应用”获省政府三等奖。

黑龙江省兽医科学研究所

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