本项目旨在明确钙池引发的钙离子的进入(Store-Operated Ca2+ Entry, SOCE)对奶牛低钙血症中性粒细胞NETs形成过程的调控机制。本实验采集产后2天奶牛血液，依据血钙Ca2+>2.10 mmol/L（健康对照组）或<2.00 mmol/L（低钙血症组）标准，筛选健康对照组和低钙血症组奶牛各10头，分离外周血中性粒细胞。中性粒细胞进行如下处理：利用佛波12-肉豆蔻酸13-醋酸酯（PMA）刺激形成NETs；分别用或不用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）、肌内质层Ca2+ atp酶抑制剂thapsigargin（TG）或SOCE关键因子ORAI1阻断剂2-氨基乙氧基苯硼酸(2APB)预处理健康对照组和低钙血症组的中性粒细胞，然后用PMA处理以刺激NETs的形成；健康对照组奶牛中性粒细胞转染小干扰ORAI1（siORAI1），利用PMA刺激诱导NETs的形成。通过单因素方差分析组间差异，结果显示，与健康对照组相比，低钙血症组奶牛中性粒细胞形成的NETs的DNA丝减少，MPO和中性粒细胞弹性酶（NE）向细胞核的易位减少。与健康对照组相比，低钙血症组奶牛中性粒细胞线粒体膜通透性转换孔（mPTP）开放程度更加明显，ROS生成降低，线粒体损伤增加。此外，添加NAC显著降低了NETs的形成，TG显著增加NETs的形成和ROS的生成，2APB阻断ORAI1则降低了NADPH氧化酶、ROS的水平和NETs的生成，siORAI1也显著降低了中性粒细胞胞内Ca2+浓度、NETs的形成和ROS水平。总之，本实验表明奶牛低钙血症下可能通过降低外周血中性粒细胞SOCE通路关键因子ORAI1水平，进而降低细胞内Ca2+水平，导致线粒体功能受损，ROS水平低下，最终导致NETs的形成降低。同时本研究通过对健康奶牛和低钙血症奶牛中性粒细胞RNA测序分析差异基因表达，利用GO和KEGG富集分析差异表达基因。结果显示，与健康对照组相比，低钙血症组奶牛中性粒细胞中有158个基因显著上调，296个基因显著下调。其中白细胞介素-12（CXCL12）、L1细胞黏附分子（L1CAM）、髓过氧化物酶（MPO）等基因表达显著降低，提示低钙血症奶牛中性粒细胞免疫功能下降。低钙血症奶牛中性粒细胞钙结合通路相关基因表达下降，提示中性粒细胞免疫功能下降与钙离子有关。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（CDKN1A）、穿孔素1（PRF1）、同源域结合蛋白激酶3（HIPK3）等基因表达显著增加，提示低钙血症奶牛中性粒细胞显著增加细胞凋亡和衰老水平。表明低钙血症奶牛中性粒细胞存在细胞钙调控通路异常、免疫功能相关指标低下特征。本研究为全面阐释奶牛低钙血症致病机制、为治疗和干预围产期奶牛低钙血症技术研发打开新途径。

黑龙江八一农垦大学

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