1.课题来源与背景：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（面上项目-12541919） 2.技术原理及性能指标：本实验体外成功分离纯化并扩增BMSCs;反复传代后仍能保持其原有的形态特点和分化能力;BMSCs经尾静脉注入后，可以通过抑制caspase-3，Bax表达、上调Bcl-2表达，发挥抗细胞凋亡的作用；骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植后可促进放射性脊髓损伤大鼠运动功能的恢复，对大鼠脊髓损伤具有修复作用。明确G-CSF对放射性脊髓损伤的作用，其与骨髓间充质干细胞移植联合应用是否增加疗效起到协同作用。本研究体外培养骨髓间充质干细胞，以后可以尝试体外培养神经干细胞，治疗放射性脊髓损伤，乃至其他神经系统损伤。另外本研究应用骨髓间充质干细胞联合应用G-CSF治疗放射性脊髓炎，下一步可应用于放射性肺炎、放射性肠炎等多种放射性相关疾病的治疗。具有广阔前景。为骨髓间充质干细胞的临床应用提供可靠的实验室依据。打下夯实基础，提供坚实理论根据。 3.技术的创造性与先进性：本课题是结合国内外关于骨髓间充质干细胞（BMSCs）移植后在不同程度上有利于神经结构和功能修复，结合放射性脊髓损伤的机制，凝练出科学问题并提出了自己的假说。因此本课题具有理论上的创新；近几年国内外学者的研究侧重放在骨髓间充质干细胞对于外伤性脊髓损伤的修复等作用机制，而关于放射性脊髓损伤中作用的研究鲜有报道。本课题将明确骨髓间充质干细胞联合应用G-CSF在预防、减轻、治疗放射性脊髓损伤中的重要作用。此治疗方法对脊髓放射性损伤提出了全新的治疗思路，同时也拓宽了骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞联合应用G-CSF治疗神经系统变性及损伤性疾病的适应证，本研究将为骨髓间充质干细胞的临床应用提供可靠的理论依据；本课题首次通过观察骨髓间充质干细胞移植骨髓间充质干细胞联合应用G-CSF调节放射性脊髓损伤中凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达，影响放射性脊髓损伤细胞凋亡，从而揭示其预防、减轻及治疗放射性脊髓损伤的作用机制。因此，本课题具有很强的创新性；本课题的实验设计中具有系统性的创新特色，采用流式细胞计数法、免疫组化染色法、行为运动学指标 BBB评分法、组织细胞病理形态学等手段，从分子、细胞、组织以及动物水平等等多层次实验设计，来观察骨髓间充质干细胞对预防、减轻或治疗放射性脊髓损伤作用，并探讨其机制。 4.技术的成熟度，适用范围及安全性：骨髓间充质干细胞，由于在体内数量较少，但是其易于分离、扩增迅速和多分化潜能，使其体外培养能为可能，国内外已有大量体外成功分离培养鉴定大鼠骨髓间充质干细胞研究。很多研究通过动物实验已经明确了骨髓间充质干细胞移植后在不同程度上有利于神经结构和功能修复。相关研究表明脊髓损伤时可引起细胞凋亡及相关凋亡因子的改变，且骨髓间充质干细胞具有抑制细胞凋亡的作用，从这一层面，为本实验提供理论依据及相关前期研究基础。有市级前期关于骨髓间充质干细胞和放射性脊髓损伤科研项目实践及取得的研究成果的基础，相应技术支持及人员梯队。有符合国家级标准实验室支持（细胞培养室、病理室、分子生物学实验室）。与本课题有关的装备精良的设备：透射电子显微镜、超薄切片机、流式细胞仪、超速离心机、荧光显微镜流式细胞仪、直线加速器。明确骨髓间充质干细胞联合应用G-CSF对放射性脊髓损伤细胞凋亡的影响：抑制Caspase-3，Bax表达、上调Bcl-2表达，具有抗细胞凋亡的作用。且具有改善和减轻脊髓损伤症状及病理结构破坏作用，对放射性脊髓损伤具有治疗作用。为临床骨髓间充质干细胞联合应用G-CSF治疗放射性骨髓损伤提供实验室依据。 5.应用情况及存在的问题：骨髓间充质干细胞移植对放射性脊髓损伤中起何种的作用? 是加重、预防、减轻、治疗还是没有作用？这是本项目拟解决的关键科学问题之一。本项目将应用运动行为学、组织细胞病理学等研究明确骨髓间充质干细胞移植对放射性脊髓损伤中起何种的作用。骨髓间充质干细胞移植是否通过调节放射性脊髓损伤中凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达，影响放射性脊髓损伤细胞凋亡，从而揭示其预防、减轻及治疗放射性脊髓损伤的作用机制? 这是拟解决的关键科学问题之二。本项目将采用流式细胞术测量各组细胞凋亡率，凋亡细胞的流式细胞检测变化，采用免疫组化染色法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达水平，探讨骨髓间充质干细胞移植如何通过调节放射性脊髓损伤中凋亡因子Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达，影响放射性脊髓损伤细胞凋亡，从而揭示其预防、减轻及治疗放射性脊髓损伤的作用机制。大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养 、接种这是拟解决的关键技术问题。本项目将利用目前广泛采用的贴壁法，确保大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养。本实验通过大鼠尾静脉注射利用骨髓间充质干细胞放射损伤部位的归巢特性，对大鼠脊髓放射性损伤部位起作用。

齐齐哈尔医学院

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