利用秸秆等可再生的纤维素资源生产乙醇，作为一种替代的生物质能源已经引起了广泛关注。采用微生物降解将纤维素转化成乙醇等已成为纤维素资源再生利用研究的热点。绿色木霉（Trichoderma viride）具有高效的纤维素酶体系，分解天然纤维素的能力较强。菌种的筛选、选育、基因工程和细胞工程等是提高纤维素酶的产量和活力的关键。本研究采用复合诱变方法对绿色木霉（T. viride）菌株进行诱变选育及发酵条件研究、对绿色木霉的纤维素酶基因在转录水平上分析、构建高效表达载体、克隆纤维素酶系基因、转化酿酒酵母（Sacharomyces cerevisiae）并对重组酶的酶学特性进行分析，结果如下： 以绿色木霉（T. viride）为材料，采用硫酸二乙酯和紫外线复合诱变方法，以绿色木霉（T. viride）为材料，采用复合诱变方法，对诱变菌株采用响应面方法进行液体发酵条件优化，结果为碳（稻草：玉米秸秆= 6:1 ） 26.91g/ L ，氯化铵3.77 g / L的磷酸二氢钾5.31g/ L和碳（稻草：玉米秸秆= 6:1 ） 26.99g/L，氯化铵3.80g/ L ，磷酸二氢钾5.23g/L，内切葡聚糖酶的活性为41.46 IU /g。 以绿色木霉（T. viride）AS3.3711菌株为材料，用RT-PCR方法，克隆出2种内切葡聚糖酶（EGⅦ、EGⅧ）基因的cDNA序列。经测序比对为完整的基因序列，在GenBank数据库上登记号为EU518927（egVII）、EU518928 (egVIII)。egVII、egVIII cDNA序列长度分别为782bp、1342bp，分别编码249、438个氨基酸，理论分子量为26.80、46.85kDa，理论等电点为7.62、4.32。均存在信号肽，为胞外酶。EGVII属于糖苷水解酶家族61。EGVIII属于糖苷水解酶家族5。 绿色木霉的egVII、egVIII在含有纤维素的培养基中大量诱导表达，在CMC-Na、秸秆、MCC中表达量高，说明绿色木霉具有较强的降解天然纤维素的能力。 成功构建带有酿酒酵母α- factor (MFα) 的酿酒酵母表达载体pYEMα。将egVII、egVIII与载体pYEMα连接，构建了重组质粒IpYES2-egVII、IpYEMα-xegVII、IpYES2-egVIII、IpYEMα-xegVIII并转入到酿酒酵母中。在转录水平上表达丰度随时间变化呈现一定规律，egVII在48h达到表达高峰。egVIII在24h达到表达高峰。 酿酒酵母重组酶EGVII最适酶解温度为60℃，最高pH值为5.5左右， pH在4.0-6.0范围内酶活性较稳定，35-65℃范围内酶的稳定性较高；酿酒酵母重组酶EGVIII最适酶解温度为60℃，最高pH值在6.0左右，pH在3.5-7.5范围内酶活性较稳定，在35-70℃的范围内酶活性较稳定。 绿色木霉的egVII、egVIII在含有纤维素的培养基中大量诱导表达，在CMC-Na、秸秆、MCC中表达量高，说明绿色木霉具有较强的降解天然纤维素的能力。 为酿酒酵母以秸秆为底物一步生产酒精和高密度发酵生产纤维素酶的奠定了理论基础和技术支撑。

黑龙江农业职业技术学院

该项目为储备库项目资源，暂无效益分析内容。